- 上一篇：凤眼莲在稀土废水中的生长研究
- 下一篇：空间诱变微生物其代谢产物抗肿瘤活性的研究
1.3 课题研究目的及意义
微生物本身代谢戊糖的能力是决定植物纤文原料水解液戊糖发酵成败的关键。拜氏梭菌对木糖利用的能力偏低且发酵时间长成为纤文素丁醇制备的限制性瓶颈。这些菌株发酵木糖仍然比葡萄糖效率低。木糖发酵的主要瓶颈在由氧桥的还原途径被认为是由于不同的辅因子，XR和XDH的酶（科特和Ciriacy1993）的特异性的氧化还原失衡。另一个限制是有可能的摄取进入细胞内的木糖[12]。
许多硬壁菌门菌的细菌,包括溶剂生产梭状芽胞杆菌如丙酮丁醇梭菌,能够利用木糖,木糖是自然界一个丰富的碳源。然而,在他们中的大多数同源性搜索未能识别所有的木糖和木糖甙利用途径完整的基因。此外,除了芽孢杆菌，木糖代谢在许多厚壁菌门的调控机制仍不清楚[23]。
提高木质纤文资源利用率的关键是要解决生物对戊糖利用的低效率问题,以及解除微生物的底物偏好性问题,实现对复杂原料多组分的同步高效发酵。高效利用木质纤文素的技术关键之一就是提高微生物对戊糖的利用能力,实现戊糖和己糖的同等发酵。
中科院微生物代谢调控与代谢工程研究组发现并鉴定了菌株中的木糖代谢特异性调控因子XylR。该因子对木糖代谢途径具有很强的抑制作用，仅靠木糖诱导难以解除其抑制效应，而敲除xylR 基因明显提高了菌株的木糖利用能力。此外，课题组采用强度合适的启动子对木糖转运蛋白进行了过量表达，进一步优化了菌株对木糖的利用。
拜氏梭菌感受木糖信号机制在以前是没有研究过的，双组份调控系统(TCS系统)由感受蛋白和调节蛋白组成，是细菌的一种普遍而又重要的信号传递系统，也是一个基因表达的调节系统。具有信号传递和基因调节两个基本功能[27]，是细菌中主要的信号转导模式。在拜氏梭菌木糖转运、酶及调控基因簇中发现双组份LytS（组氨酸激酶 Classic）-YesN（应答调控蛋白 Arac family）（Cbei2378、Cbei2379）。LytS-YesN中包含了经典双组份调控系统(TCS)的各个功能域。
图1-2 双组份系统
LytS-yesN是自身正调控的，并且这对双组份在高糖浓度下正调控。xylFGH实验室预测xylF（Cbei2380）、xylG（Cbei2381）、xylH（Cbei2382）为木糖转运的ABC transporters，xylF是D-木糖运输系统的底物结合的蛋白质，1080bp，为D-木糖ABC转运胞质蛋白；xylG是D-木糖运输系统ATP结合蛋白，1578bp，为糖ABC转运ATP酶；xylH是D-木糖运输系统通透蛋白，1170bp，为单糖转运ATP酶。在LytS-YesN双组份之前有另外一个xylF（Cbei2377），命名为xylFII，猜测可能与ABC transporters中的xylF功能相同，为木糖转运底物蛋白，可能与xylG、xylH组成ABC transporters。
本课题拟以拜氏梭菌模式菌株C. beijerinckii NCIMB8052 基因组数据为依据，通过生物信息学分析、基因缺失和功能互补实验确定木糖代谢途径上关键酶基因的编码序列；为进一步提高菌种的木糖利用能力奠定基础。
2.材料与方法
2.1实验材料
2.1.1 主要试剂
表2-1 主要试剂一览表
试剂名称 纯度 生产厂家
木糖 分析纯 国药集团化学试剂有限公司
Biowest 分析纯 Distributed by Genecompanyltd
Buffer S1 分析纯 爱思进生物技术（杭州）有限公司
Buffer S2 分析纯 爱思进生物技术（杭州）有限公司
Buffer S3 分析纯 爱思进生物技术（杭州）有限公司
Buffer W1 分析纯 爱思进生物技术（杭州）有限公司