- 上一篇：气相色谱对十大功劳叶单糖成分的分析
- 下一篇：不同条件的种子培养对里氏木霉产纤维素酶的影响
2.3主要仪器和试剂
2.3.1仪器：
苏州净化双人单面净化工作台、酶标仪、多功能摇床、恒温培养箱、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉等。
2.3.2试剂：
滤纸、3,5-二硝基水杨酸（DNS）、柠檬酸缓冲溶液（pH 4.0）、含10 g/L的CMC-Na柠檬酸缓冲液（pH 4.6）、羧甲基纤维素钠、Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH 6.4）
2.4实验方法
2.4.1培养基的处理
将固体培养基放在高压灭菌锅中灭菌，灭菌完成后稍微冷却将固体培养基倒平板，5至6天后再配置液体培养基并灭菌。
2.4.2缓冲液的制备
2.4.2.1含10 g/L的CMC-Na柠檬酸缓冲液（pH 4.6）
取0.2 mol/L Na2HPO4 9.35 mL，0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液10.65 mL，加水定容至100 mL，加1 g CMC-Na加热溶解备用。
2.4.2.2 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液（pH 6.4）
取0.2 mol/L Na2HPO4 13.85 mL，0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液6.15 mL，加水定容至100 mL备用。
2.4.3菌种活化
将在冰箱中保存的纤维素酶菌种接入到固体培养基上，恒温28℃培养5-6 d。
2.4.4液体摇瓶培养
从培养皿上挑取生长良好的菌株1-2环，接种到装有100 mL液体培养基的500 mL锥形瓶中，每种菌接种2-3瓶，共五种，在28℃、150 r/min的摇床上培养至对数期中后期。
2.4.5粗酶液的制备
每次每种菌液取500 μL发酵液于6000 r/min条件下离心2 min，得到的上清液即为粗酶液。
2.4.6酶活测定[1]
2.4.6.1酶活测定的原理
DNS即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，DNS与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。因其显色的深浅只与糖类游离出还原基团的数量有关，而对还原糖的种类没有选择性，故DNS方法适合用在多糖（如纤维素、半纤维素和淀粉等）水解产生的多种还原糖体系中。
DNS 试剂配制[9]：
取6.3 g DNS和262 mL浓度为2 mol/L的NaOH溶液加到500 mL含有182 g酒石酸钠的热水溶液中，再加5 g重蒸酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000 mL，贮于棕色瓶中，7~10 d后使用。
酶活力单位定义：在一定条件下，由1 mL酶液催化反应1 min所生成的葡萄糖的μg数定义为一个酶活力单位，用U表示[1]。
酶活的计算：CMC酶活单位= (G*B)/(0.1*30) (μg/mL.min.50°C)
其中，G：样品中葡萄糖含量(μg)；B：酶液稀释倍数；0.1：吸取酶液的数量(mL)；30为糖化时间(min)。