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3.4.2 菌体的准备 14
3.4.3 电击转化 15
3.4.4 诱导产酶培养 15
3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳 15
3.5.1 染色和脱色 15
3.6 弹性蛋白酶酶活力的测定 15
3.6.1 酶蛋白在对温度的稳定性 16
3.6.2 酶蛋白在有机溶剂中的稳定性 16
3.7 酶蛋白的纯化 16
3.7.1 重组蛋白酶的纯化 16
4 结果与讨论 16
结论 21
参考文献 22
致 谢 23
引言：
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，是人体典型机会致病菌，在烧伤、免疫缺陷、器官移植及一些医院感染病人中引起严重感染，严重危害大家的健康和生命，威胁到整个社会的稳定。该菌可以产生多种有害的致病性物质，其中的弹性蛋白酶，其英文术语为pseudolysin，该蛋白酶是一种以水解不溶性弹性蛋白为主要特征的蛋白水解酶，在医学临床主要用于高血脂症，防止动脉粥样硬化等疾病的治疗。也可用于肉类和水产加工中的嫩化。弹性蛋白酶属基质金属蛋白酶中的第4族，由lasB基因编码，为胞外分泌型蛋白酶，该基因编码区全长1497bp,编码蛋白为498个aa，其中1-23位aa为信号肽，24-498位aa为前弹性蛋白，该蛋白在胞外分泌过程中通过细菌外膜后，在197位的His(H)与198位的Ala(A)之间，通蛋白酶切割，活性成熟蛋白为靠近C-端的301个氨基酸残基[1]。其成熟蛋白分泌至胞外，降解病灶细胞外基质，在铜绿假单胞菌感染过程中起重要作用。因此，获得纯化的弹性蛋白酶，对于研究其致病机理，具有重要意义。
弹性蛋白酶医疗上具有很高的应用价值，同时它在食品工业、日用化学工业中具有很好的前景，具有较高的商业和应用价值[2-4]。在医药产品方面，具有维持纤维血管正弹性的独特功能，对治疗高血脂等症疗效显著；对于治疗和预老年心血管病、增进中老年人身体健康水平具有重要意义。除此之外，该酶外用还用于有效治疗烧伤病患及皮肤溃疡等一系列病症；在食品工业上，利用弹性蛋白酶能降解许多动、植物蛋白，可用它来进行农副产品的深加工，制作高蛋白食品，并可在加工业等方面得到广泛应用。同时弹性蛋白酶能够专一降解结缔组织中比较坚韧的弹性纤维组分，因而可作为理想的肉类嫩化剂；在日用化学工业上弹性蛋白酶认为能起增进、改善皮肤的血液循环的作用，并能改善皮肤脂质代谢，增强皮肤、毛发的弹性和延缓皮肤老化，减少皱纹及色素在体内的沉积，还能促进毛发的生长，可以有效的防止脱发、掉发[5]。源'自:751`!论~文'网www.751com.cn
我国的弹性蛋白酶通常的制备方法是由用水提取动物的胰脏部位而得[6]。或者通过直接从细菌培养上清中提取弹性蛋白酶，但是产量低、纯化困难，不能很好地满足研究工作和市场需要[7]。现在我们试着利用微生物发酵表达，通过一系列生物化学手段来解决这一问题[8]，如果利用基因工程手段建立表达性工程菌以大量制备高纯度弹性蛋白酶，将为对该酶的进一步研究和开发提供良好基础。
通过查阅相关文献我们知道，外源基因能否成功表达的一个关键环节是选择合适的蛋白表达系统，而毕赤酵母是近几年新兴发展的、相对比较完善的、广泛被用来表达外源蛋白的一类甲醇营养型酵母表达系统，与其他表达系统相比，该系统所具有着许多优点与优势使其研究价值和应用价值越来越广泛[9]，通过毕赤酵母已经成功表达了多种蛋白质，因此在本实验中我们选用毕赤酵母作为表达载体。