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我国水产品养殖疾病控制，目前应用比较多的就是各种抗生素。抗生素长期使用对水产动物以及人类的健康都有一定的影响，化学药物用得比较多的时候，对生态环境有一定的破坏作用。水产动物控制流行病的有效方法就是生物疫苗的使用，这是解决病毒的一种有效途径，也是唯一的一种手段。生物疫苗能提高动物对特异性疾病的抵抗力，且不会造成环境污染、养殖产品药物残留等问题，已成为水生动物疾病防治研究的主流方向。生物疫苗主要有传统疫苗、基因工程疫苗两种。其中基因工程疫苗有基因工程亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗、核酸疫苗等。基因工程亚单位疫苗的方法是指利用基因工程技术,克隆出微生物中编码保护性抗原肽段的基因,并与质粒等载体重组,然后导入到受体菌细胞中,使它在受体菌中进行表达产生大量保护性肽段。然后提取纯化产物并加入佐剂即成为亚单位苗。生物疫苗在水产动物疾病预防中有广泛的应用前景且有非常实用的学术价值。
结构保守的两个蛋白DnaK（热激蛋白70，Heat shock protein 70）和DnaJ（热激蛋白40，Heat shock protein 40），是水生动物处于正常生存环境以及承受逆境压力时发挥重要分子伴侣功能的物质（Fan et al., 2003）。一些免疫试验研究发现不同细菌DnaJ和DnaK的重组蛋白对宿主具有良好的免疫保护作用（Khan, 2006; Dang et al, 2011; Paliwal et al, 2011）；另一些研究虽未发现DnaK良好的免疫保护效应，但DnaK能够提高宿主的体液免疫反应（Héchard et al, 2003）[4]。本研究通过PCR技术从嗜水气单胞菌基因组中获得DnaK和DnaJ基因，利用原核表达系统对这两个基因进行过量表达并纯化获得重组蛋白，采用弗氏佐剂作为免疫佐剂制备亚单位疫苗，将所制备的亚单位疫苗注射中华鳖幼鳖观察计算各实验组幼鳖的成活率，为预防嗜水气单胞菌单胞菌感染中华鳖做好技术基础。
1.材料与方法
1.1实验材料
本实验所用嗜水气单胞菌AHTL1，系本实验室从余杭某养殖场病鳖肝脏中分离获得。感染嗜水气单胞菌的病鳖的主要病理症状为：食欲不振，反应迟钝，对外界反应不敏感；皮肤有大小不一的溃烂灶，这些溃烂灶常见于背腹甲和四肢，口腔等。肺暗红色，切开有泡沫液体流出，肝肿大等。从养殖场购买的病鳖中挑取具有典型病理症状且濒临死亡的病鳖，然后用清水冲洗干净后，并用75%的酒精棉拭擦病鳖表面。用无菌的解剖工具沿鳖腹甲边缘剖开，取少量肝脏、肾脏、脾脏组织分别在普通营养琼脂平板上作平板划线分离。然后在28℃下培养24小时左右后进行观察，待有单个菌落长出后选取单个菌落接种斜面。将分离得到的菌株进行生化试验鉴定，得到嗜水气单胞菌AHTL1。本实验所用的中华鳖幼鳖购于浙江杭州某养殖场，重量都在7g左右。