大麦是中国第四大粮食作物,取得大麦育种的突破性进展对国民经济生产和发展具有十分重要意义。但是大麦育种家同样面临着亲本遗传基础狭窄的困境[1],亟需加强遗传资源的引进及其农艺性状特征和遗传基础的了解与掌握。对现有亲本材料进行遗传多样性研究,可有效减少相似遗传背景的组合,减少育种的工作量,对于亲本的杂交组合配置具有重要的指导意义。同时,寻找与目标性状相关的分子标记,可以为复杂数量性状的遗传学研究和分子标记辅助育种奠定重要基础。随着分子生物学技术的发展,分子标记种类及检测手段日趋完善,分子标记技术已广泛应用于大麦的遗传多样性研究[2-5]。
SSR标记又称为(sequence tagged microsatellite site),简写为STMS,是目前最常用的微卫星标记之一。由于SSR重复数目变化很大,所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性。它有数量丰富,覆盖整个基因组,揭示的多态性高;具有多等位基因的特性,提供的信息量高;以孟德尔方式遗传,呈共显性;每个位点由设计的引物顺序决定,便于不同的实验室相互交流合作开发引物以上4个优点。
国外学者对大麦的遗传多样性研究开展较早[6]。Saghai-Maroof等首次采用SSR标记技术对207份材料(103份以色列不同生态区的二棱大麦和104份世界大麦主产区的栽培大麦)的遗传多样性进行了研究,4个标记共检测到71个等位变异。随后SSR标记技术被广泛应用于大麦遗传多样性分析。
1 材料和方法
1.1.1实验材料
92份大麦来自于亚洲各国。
1.1.2实验试剂
实验试剂:液氮、3%H2O2、十六烷基三甲基溴化铵(阳离子去污剂)、氯仿、异丙醇、75%酒精、双蒸水、2×Specific Taq Master Mix、2×Taq PCR Master Mix、硝酸银、5×TBE、4% PA、10%Ammonium persuifate、TEMED、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、硼酸、0.5mol/l EDTA、甲醛、蒸馏水、Loading buffer、DL2000 DNA Marker、DM1001 DNA Marker。
1.1.3实验仪器
实验器材:培养箱、2ml离心管、1.5ml离心管、量筒、烧杯、PCR板、记号笔、玻璃棒、研磨仪、水浴锅、灭菌锅、冰箱、制胶模具、微波炉、离心机、电泳仪、PCR仪、移液枪、镊子。
1.2实验方法
1.2.1植物培养与处理
取大麦种子10粒,用3% H2O2消毒并以蒸馏水冲洗,加入大麦培养液在黑暗中培养2天,将种子转入光照时间16h、昼夜温度在22℃±2℃的人工智能气候箱内培养10天。每株收集一片大麦叶片,截取幼嫩部位长约3厘米,用镊子将叶片放入2ml离心管内,并将相应的DNA序号用记号笔标记排序放入盒中待用。加入研磨珠子,将离心管批量放入研磨仪。