苦苣菜黄网病毒P蛋白单克隆抗体的检测应用(2)

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随着生物技术的快速发展，植物病毒的检测方法和手段也不断的有所创新和改进，并朝着灵敏、快速和准确的方向发展。早期植物病毒的检测主要依靠生物学性状，包括植株本身的外观特点和指示植物等来进行。然而，依靠生物学性状检测的方法有许多的缺点。不仅易出现重复性差、反应不稳定等现象，而且费时费力检测周期长，特别是容易受环境因素的影响[4]。自从二十世纪六七十年代以来，血清学技术逐步崛起，利用血清学方法使许多植物病毒能够被检测出来。植物病毒是一种核蛋白，是由蛋白质和核酸组成，也是一种很好的抗原。通过特异性的抗体与对应的抗原相结合，使抗原失去原本的活性，这样的过程称之为免疫反应，也称之为血清反应。可以利用不同类别的病毒产生的抗血清有各自独特的性质这一特性，对于病毒种类的鉴定可以通过已知病毒的抗血清完成[5]。随着血清学技术的快速发展，利用血清学方法检测病毒的优势尤为突出，不但使植物病毒检测的特异性增强，而且灵敏性和检测速度也大大提高了。现今，利用血清学方法检测植物病毒成为最便捷的方式之一，其中酶联免疫吸附法Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA)应用最广泛[6]。

ELISA的检测最早是应用于动物病毒，在二十世纪七十年代，才开始应用于植物病毒的检测[7-9]。ELISA采用的是免疫酶技术和固相吸附相结合的方法，它的基本原理是：在不影响免疫球蛋白和酶活性的免疫反应前提下，将酶分子和免疫球蛋白分子通过共价结合形成酶标记抗体。酶标抗体再通过免疫桥特异性的结合被包被在固相支持物上的抗原和抗体，使得在固体表面上进行免疫反应。并利用抗原或抗体上结合的酶与底物反应所表现出来的颜色进行检测。它所具备的优势：不仅保持了酶催化的活性，而且提高灵敏度，特异性强，操作简便。同时克服了传统血清学方法受某些因素的限制，如病毒粒子形态、浓度和抗血清用量等[10-11]。

单克隆抗体检测植物病毒是通过抗体与抗原的特异性结合，具有灵敏度较高、特异性强的特点，由于其快速、准确、简便，因此具有较高的实用价值，能在多种植物病毒上广泛应用。目前，在对植物病毒的诊断分析中应用最广泛的是马铃薯病毒单抗[12-14]。包括应用到马铃薯卷叶病毒（Potato leaf-roll virus，PLRV）和A、M、S、X和Y病毒等检测鉴定。马铃薯Y病毒是危害马铃薯和烟草等作物的重要病毒，Ismail MH [15]建立的ELISA方法可用于快速检测作物中马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）且与马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）、马铃薯Y病、烟草花叶病毒等均无交叉反应。该方法由于高效、廉价，因此在马铃薯Y病毒研究中具有重要应用价值。吴建祥等[16]制备了马铃薯 X 病毒云南分离物单克隆抗体，用于检测马铃薯X病毒，发现病叶经1∶600稀释、提纯的病毒浓度为2ng /mL时，仍能检测到病毒。王贵珍等[17]制备了水稻条纹病毒 (Rice stripe virus，RSV) 单克隆抗体，检测病汁液的稀释度能达到2560倍以上，而且与其他病毒无交叉反应；建立了利用ELISA检测RSV的方法，且成功地用于检测灰飞虱的带毒率，发现灰飞虱的带毒率达12.5% ~ 41.5%。施曼玲等[18]制备了芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）单克隆抗体，通过建立了三抗体夹心ELISA检测TuMV的方检测病叶的灵敏度为1∶5120，检测提纯T uM V的病毒绝对量为21.9 ng。此外，文献报道的利用单抗检测病毒的还有：蚕豆萎蔫病毒（Broad bean vascular wilt virus，BBWV）[19]、建兰花叶病毒( Cymbidium mosaic virus，CymMV)[20]等。

苦苣菜黄网病毒(Sonchus yellow net virus，SYNV)是一种细胞核内复制的负链RNA病毒，它侵染菊科植物，在莴苣等农作物上造成病毒病害。SYNV属于弹状病毒科细胞核弹状病毒属，该科成员引起大量人类、野生动物和农业上的严重病害，造成重大经济损失，甚至一些对人类健康构成致命威胁。SYNV病毒粒子包含的核衣壳由一条负链RNA和 N、P、L蛋白组成。SYNV基因组由6个基因组成，依次为3′-N-P-sc4-M-G-L-5′。SYNV的P蛋白在病毒侵染过程中起着重要作用，能与N蛋白互作来调控病毒复制和转录之间的转换。本课题拟利用已制备P蛋白的单克隆抗体，建立间接ELISA检测方法，用于检测SYNV病毒、原核表达的P蛋白，以及在植物体内通过真核表达载体表达的P蛋白。从而为防治SYNV病毒以及为研究P蛋白与寄主的互作奠定基础。