地黄基因组DNA提取方法的优化(2)

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参考文献 11

致谢 13

地黄基因组DNA提取方法的优化引言

地黄(Rehmannia glutinosa)为玄参科(Scrophulariaceae)地黄属(Rehmannia)多年生草本植物*751^文-论;文~网www.751com.cn，主要分布于中国、韩国和日本等地 [1]，在我国，主要产于河南、河北、山东、山西、内蒙古及东北，现全国大部分地区都有栽培。地黄的根部为传统中药之一，因炮制方式不同其药效有较大差异。现代科学证明地黄的主要化学成分为糖类、苷类和氨基酸，并以苷类为主，在苷类中又以环烯醚萜苷为主 [2]。且发现其成分中的低聚糖中的水苏糖具有防癌、抗肿瘤、增进健康等功能 [3]。地黄苷 A有增强免疫功能的作用 [4]。梓醇具有降低血糖、改善学习记忆力的作用，地黄水提液能够保护胃黏膜，抑制肺纤维化，还具有促进造血、抗炎和促进血管内皮细胞增殖等作用 [5-6]。

目前，对地黄的研究主要包括地黄药用部分化学成分的分析和药理实验、品种间性状差异、组织培养、病毒研究等方面 [7]。随着分子生物学的蓬勃发展，如遗传多样性分析、遗传图谱的构建、抗病基因的分子标记等。许多分子生物学技术应用于地黄，常用技术方法主要包括：分子杂交技术、分子标记技术、基因芯片、基因工程技术、蛋白质分析技术、生物转化技术 [8]。地黄研究中使用的分子标记较多，在进行地黄遗传多样性评价、分类鉴定、指纹图谱等方面，主要用到的基因组DNA分子标记有RAPD、ISSR [9]、ITS [10]、AFLP [11]和SRAP [12]。近年来，SCAR标记、ITS2条形码序列等分子标记应用于地黄的分类和鉴别 [13]。此外，还有对地黄功能基因组的研究，尤其是与次生代谢产物相关的基因，以及进行核心种质资源的构建等等。而开展上述分子生物学研究时，皆是在DNA或者RNA的基础上进行的，其提取方法的优劣将会影响到后续实验的开展。而且，植物细胞有细胞壁，含有很多的糖类、酚类等次级代谢产物。不同植物中的次级代谢产物，其种类和含量也不一样，同一种植物的不同组织器官的次级代谢产物的种类和含量也可能不尽相同，故要获取高质量的DNA存在一定的难度 [14]。对于某个特殊物种的DNA提取方法优化可能并不完全适用于其它物种，孙鹏等摸索出可以适用于地黄不同组织器官的简便、经济的 RNA 提取方法 [15]，但对于地黄基因组DNA提取方法优化未见报道，在查阅大量相关文献后，本文介绍了一种改良的CTAB法结合各种实验处理，探索提取地黄基因组DNA效果最佳的条件组合。

1基本原理

十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法是一种阳离子去污剂，它能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物而使DNA和多糖分开，只是不能沉淀核酸。在该法中使用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)与多酚结合形成复合物，从而可有效避免多酚类化合物介导的DNA降解，以及使用β-巯基乙醇有效防止酚氧化为醌，防止褐化[16]。再通过24:1的氯仿/异戊醇抽提使得蛋白质变性、分层，然后用离心获得含有DNA的上清液，以去除蛋白、多糖、酚类等杂质，加入乙醇沉淀可使核酸分离出来，从而达到提取和分离纯化DNA的目的。