利用关联分析发掘水稻剑叶角度对BR高度敏感的有利等位变异(2)

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育种实践表明,水稻株型与产量潜力密切相关。理想株型是当前水稻超高产育种的重要研究内容[2]，而剑叶角度则是构成水稻理想株型的重要指标之一，同时也是影响水稻产量的重要因素。较小的剑叶角度，可增大叶片受光面积、提高光合效率，并有效地抑制病虫害，有利于产量的提高，但不利于不育系受粉，使杂交稻制繁种产量下降[3,4]。

杂交水稻指选用两个在遗传上有一定差异，同时它们的优良性状又能互补的水稻品种，进行杂交，生产具有杂种优势的第一代杂交种，用于生产。1970 年，研究者在油菜花粉中分离出一种具有极强生理活性的物质，它能够引起菜豆幼苗节间伸长、弯曲、裂开等异常生长反应,并将其命名为油菜素(Brassin)[5]。1979 年,研究者从 227 kg油菜花粉中提取得到 10 mg 的高活性结晶物,通过 X 光衍射和超微量子分析确定了其分子结构,认为是一种甾醇内酯化合物, 并将其命名为油菜素内酯(Brassinolide,BR1)[6] 。水稻中，BR调控影响作物产量的许多性状，如植株大小、籽粒重量、植株分蘖和叶片角度等。水稻杂交制种在生产过程中为提高异交结实率需要采取人工授粉、割叶和喷施激素等措施。这些措施不仅劳动强度高，操作技术强，而且需要专业知识和丰富的经验对水稻生长发育规律及时机的把握。另外，割叶造成的伤口对水稻植株的正常生长也有不利影响；而大量喷施激素既增加成本，又污染环境。因此研究BR处理水稻自然群体后的敏感反应具有重要的前景。BR可调控植株的剑叶角度，从而在杂交稻制种过程中可免割叶，减少对植株的伤害。从水稻自然群体中发掘BR高敏感性种质资源可用于改良制种性状，为研发提高制种产量，降低成本的轻型高效制种技术奠定坚实基础，进而加快杂交稻制种全程机械化进程。

1 材料与方法

1．1 供试材料

供试材料为506份水稻资源，其中385个水稻品种来自于中国以下几个省市（黑龙江、北京、天津、山东、河南、浙江、云南、辽宁、江苏、安徽、上海和台湾），121个来自于越南。以上材料均由南京农业大学杂交稻种质创新实验室提供。

1．1．1 田间种植与试验方法 2016年5月10日将供试的506份水稻资源播于南京农业大学江浦试验站水稻秧田，6月10日移栽至大田。每份资源栽插1个小区，每个小区4行，每行8株。株距20cm,行距20cm.常规田间管理。在水稻幼穗分化第三期或第四期进行BR涂抹处理。具体做法是，每个小区任选三株涂抹BR作为处理，每株涂抹主茎穗，挂牌做标记，另选三株清水处理作对照。BR涂抹方法按制种实际进行，BR总用量为0. 1mg，涂抹浓度0.1mg/mL，分三次涂抹，每天每株500ul。BR处理液购自Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司，纯度>85%，涂抹前BR 用98% 的乙醇溶解成母液，使用时再进一步稀释，乙醇最终含量为0.1%（v/v）。溶液中加入0.1%（v/v）的 Tween-20作为展布剂，使溶液易于粘附在植株表面。用脱脂棉进行涂抹。每次涂抹BR处理液时，均匀地涂抹到每株倒二叶上。

1．1．2 表型鉴定方法第三次涂抹以后每隔7d进行一次观察，至植株完成抽穗定型后调查剑叶角度。剑叶角度：剑叶叶枕以上茎秆或稻穗（如弯曲需竖直向上拉直）与剑叶所形成的夹角，精确到1°。

1．1．3 基因组DNA提取、SSR标记基因型鉴定和等位基因鉴定基因组DNA提取、PCR扩增体系、采用6%PAGE非变性胶进行电泳；电泳完毕后银染、显影。

1．2 数据分析

1．2．1 表型分析性状对外源BR的敏感性用2个指标衡量。一个是差值（difference，D）,即将由调查性状的外源BR处理平均值（average of treatment，AT）减去不作处理的对照平均值（average of check，AC）而得到。即D=AT-AC。D反映调查性状经外源BR处理后的绝对变化，当D为负值时，认为是由实验误差或取样误差造成，将D记为0。另一个指标是敏感指数（index of BR sensitivity，IBS），IBS=D/AC×100%，IBS越大，表示对外源BR的敏感性越高。