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摘要：RNAi具有特异、稳定、高效以及不改变基因组的遗传组成等特性，成为基因功能研究的重要手段。传统的RNAi载体需要经过多次酶切和多片段的定向插入，步骤繁琐，成功率不高。Gateway技术不使用限制性内切酶和连接酶，克服了传统载体构建过程中需进行的多次酶切和连接反应的繁琐操作步骤及酶切位点的限制等缺点。本研究应用Gateway技术改造双子叶植物的RNA干涉载体，经酶切验证构建的载体与预期的完全一致。39415
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毕业论文关键词：双子叶植物；RNA干涉；Gateway；
Optimization of Dicotyledonous Plants RNAi Vector by Gateway Technology
Abstract: RNAi has become an important means of gene functional studies for it regulate inpidual gene express level with specific, stable and efficient manners. The traditional RNA interference vector needs several enzyme digestion and directional fragment insertion with complicated steps, The success rate is not high. Gateway technology needn’t restriction enzymes digestion and ligases to overcome cumbersome vector construction process. In this study, we optimized dicotyledonous plants RNAi vector by Gateway technology. Exactly verified constructed vector was generated as confirmed by digest test.
Key words: Dicotyledonous plants; RNA interference; Gateway
目 录
摘要 - 1 -
引言 - 1 -
1.材料与方法 - 2 -
1.1主要材料 - 2 -
1.1.1 所用载体 - 2 -
1.1.2 菌株 - 3 -
1.1.3 酶及试剂 - 3 -
1.2 主要设备 - 3 -
1.3 实验方法 - 3 -
1.3.1 酶切 - 3 -
1.3.2 连接 - 4 -
1.3.3胶回收 - 4 -
1.3.4 大片段补平 - 4 -
1.3.5 大肠杆菌转化 - 4 -
2.结果与分析 - 4 -
2.1 PHANNIBAL载体的酶切 - 4 -
2.2 含有GATEWAY盒子载体PBS-GATEWAY-RFA 的酶切 - 5 -
2.3 PHANNIBAL单酶切补平后产物与GATEWAY盒子序列的连接，转化 - 6 -
2.4 PHANNIBAL-GW1.1和PHANNIBAL-GW1.2载体的验证 - 6 -
2.5 PHANNIBAL-GW1.1和PHANNIBAL-GW1.2载体的酶切连接 - 7 -
2.6 PHANNIBAL-GW2载体的酶切验证 - 7 -
2.7 PCAMBIA2301-GW-RNAI终载体的构建及酶切验证 - 8 -
3.讨论与展望 - 9 -
参考文献 - 10 -
致谢 - 12 -
双子叶植物RNAi载体的Gateway改造
引言
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是由双链RNA（dsRNA）介导的由特定酶参与的转录后基因沉默现象，该现象是Andrew Fire和Craig Mello等首先在线虫中发现的，是一种在真核生物中非常保守且普遍存在的机制[1]，它是通过与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(dsRNA)导入细胞后,将与之同源的mRNA高效特异的降解成21nt-23nt的小片段，促使细胞内特定基因缺失，最后达到阻止基因表达的目的[2-3]。RNAi发生过程分为起始阶段和效应阶段，起始阶段dsRNA以ATP依赖的方式与RNaseⅢ家族的双链特异性的核糖核酸酶Dicer结合后,Dicer先将dsRNA解旋，再将其裂解为21～23个核苷酸大小的片段[4]。在效应阶段，生成的siRNA与特异性酶结合形成了RNA引导的沉默复合体(RNA-induced siliencing complex,RISC),该复合物需要依赖ATP将siRNA的双链解开，通过碱基配对识别与之互补的靶mRNA，在核酸内切酶的作用下,在siRNA中点位置处将靶mRNA切断,特异性地降解与siRNA同源的靶mRNA，从而诱导内源靶基因的沉默[5]。
传统构建植物RNAi表达载体，常规采用的方法是酶切和连接，对DNA目的片段进行切割并且回收，既浪费时间过程又繁琐，并且小片段很难回收不好连接[6]，质粒载体的分子量都比较大，用酶切和连接的方法构建载体成功率不高,为了克服传统载体构建过程中需进行的酶切和连接的繁琐步骤及酶切位点的限制等缺点，本文应用Gateway技术基于同源重组构建植物表达载体 [7]。