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摘要：本文研究了热处理对奶牛卵巢颗粒细胞HO-1基因表达的影响。首先采集健康奶牛卵巢组织，并对卵巢中的颗粒细胞进行体外培养，然后采用40°C热处理细胞，从而测定热处理对卵巢颗粒细胞HO-1基因mRNA及蛋白水平的表达情况，并进一步测定细胞中HO-1代谢产物一氧化碳（CO）及细胞内信使环磷酸鸟苷（cGMP）水平，旨在揭示HO-1在热应激状态下的表达情况为进一步研究应激状态下卵泡微环境提供一定的参考依据。29476
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毕业论文关键词：奶牛；热处理；卵巢颗粒细胞；HO-1；细胞保护
Effect of heat stress on expression of HO-1in ovarian granulosa cells in vitro cultured
Abstract： In this study, the effect of heat treatment on HO-1 gene expression in granulosa cell was detected. The dairy cow granulosa cells（GCs） were cultured by using tissue inoculation method. Then the dairy cow granulosa cells were treated by heat. After heat treatment, the content of CO and cGMP in granulosa cell were determined. The objective of this study was to reveal the protective mechanism of HO-1, and to provide some references for identifying the micro-environment of follicle under stress condition.
Key words: dairy cow；heat treatment; granulosa cell ; HO-1;cell protection
目 录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 试验动物 4
1.2 主要试剂 4
1.3 主要仪器4
1.4 试验方法5
1.4.1 卵巢颗粒细胞的培养5
1.4.2 卵巢颗粒细胞热处理5
1.4.3细胞样品中总RNA的提取5
1.4.4总RNA反转录为cDNA5
1.4.5 Real-time PCR反应5
1.4.6 western blot测定HO-1蛋白的表达5
1.4.7 细胞中CO含量的检测6
1.4.8 细胞中cGMP含量的检测7
2 结果与分析8
2.1 热处理对颗粒细胞HO-1表达的影响8
2.2 热处理对颗粒细胞中CO和cGMP的影响8
3 讨论8
致谢9
参考文献9
高温对体外培养奶牛卵巢颗粒细胞HO-1表达的影响
引言 热应激是指在高环境温度中的机体对热环境所做的非特异性的生理反应的总和 [1,2]。当奶牛受到超过其本身体温调节能力的过度高温时，即产生奶牛热应激综合征，应激通过垂体-肾上腺皮质系统，使奶牛心率加快，体温升高，呼吸加深加快，消化系统功能减弱，食欲下降，营养摄取量和消化率减少，造成成年奶牛体重减轻，犊牛、青年奶牛增重减缓，奶牛整体体况下降，最终影响奶牛的生产性能和繁殖性能，产奶量降低、乳成分发生变化[3-5]，热应激时，奶牛体内产生活性氧，卵巢和卵泡发育受阻[6]。研究发现奶牛在夏季，其受孕率一般会从较冷月份的40~60%下降到10~20％或更低（Cavestany等, 1985），低的繁殖率对奶牛生产造成重大的经济损失[1]。目前虽然大多数奶牛养殖场都已经广泛使用了现代化的降温系统，但在夏季无论怎样给奶牛降温都无法实现其在冬季的受孕率，降温只能部分缓解高温应激对繁殖的影响。
在过去的十多年中，研究人员分别从卵母细胞发育、卵泡波动力学、卵泡类固醇合成能力等方面研究了热应激对奶牛繁殖的影响，研究发现热应激可抑制奶牛的卵泡发育，从而导致奶牛夏季繁殖性能下降 [2,7,8]。在卵泡发育过程中，卵泡颗粒细胞（granulosa cells，GCs）发挥重要的功能，其可以合成雌激素、孕激素，同时其还可通过发生凋亡对卵泡的发育分化起重要作用，所以在卵泡发育过程中对卵泡颗粒细胞的研究一直是研究的焦点。研究发现，高温会引起猪、小鼠卵泡颗粒细胞发生凋亡，并抑制促性腺激素受体水平[9,10]。对牛卵泡颗粒细胞体外培养的研究发现，38.5℃的高温就会引起颗粒细胞发生凋亡 [11]。其中在应激诱导的细胞凋亡的研究中，血红素加氧酶1 （hemeoxygenase-1，HO-1）越来越被人们所重视。HO-1是一种最广泛存在的抗氧化防御酶，又称为热休克蛋白32（Hsp32），其能被热诱导产生。近十年来的研究表明，在应激条件下，HO-1作为一种细胞保护的酶来发挥作用，并且越来越多的研究阐明了HO-1的抗凋亡及细胞保护的作用 [12-15]。但迄今为止，HO-1调控卵巢细胞凋亡的潜在机制尚需进一步的研究。