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1.2.2 AR156诱导抗病性是否依赖于SA、JA、以及ET通路验证
选取生长了4周的拟南芥,实验组拟南芥品种为NahG(转基因植株,体内SA积累受到抑制)、sid2-2(SA信号通路受损)、npr1(SA, JA/ET通路下游的一个蛋白,调控一些防御相关基因的表达)、jar1(JA信号通路受损)、ein2和etr1(ET信号通路受损);对照组为Col-0 WT(信号通路正常)。
选取实验组和对照组每株拟南芥上3片叶齢、长势一致的成年叶片做好标记。分3组处理,即用5.0×107 cfu•ml-1 AR156,1 μM flg22, 无菌水(对照)分别注射拟南芥叶片。24 h后在处理过的拟南芥叶片上注射浓度为5.0×105 cfu•ml-1的丁香假单孢菌番茄致病变种Pst DC3000;接种后用保鲜膜覆盖保湿12 h,揭去保鲜膜,置于22 ℃,光周期为光照10 h,黑暗14 h,相对湿度为40%-60%的温室继续培养,当植株叶片出现差异性发病表型时,对发病叶片进行取样拍照,并观察比较植株叶片发病表型差异。
接种病原菌Pst DC3000培养48 h后,对植株叶片取样进行致病性测定。取样前用75%的无水乙醇擦洗预取样的实验组和对照组的叶片两到三次后,取直径相同的打孔器截取叶片,每个截取的叶片样品分别放入一个EP管中,加10 mM Mgcl2研磨,之后吸取50 μL振荡液进行梯度稀释(吸取前将振荡液摇匀),梯度稀释后将其涂布在K.B培养基中(为确保实验准确度每个处理设置10个平行处理)。在28 ℃培养箱中培养48 h。48 h后统计菌落数,统计分析数据。
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