1.材料与方法
1.1 材料
山楂叶螨Amphitetranychus viennensis 于2016年4月1日采自中国山东泰安,寄主为桃树,样本在作为DNA提取与标本制作之前用100%的乙醇保存于-20℃的冰箱中。
1.2实验方法
1.2.1 标本制作
将保存于酒精中的螨虫挑出,在显微镜观察下操作放置于载玻片上,加入少量Hoyers溶液浸没虫体,盖上盖玻片,烘干,最终保存于南京农业大学。
1.2.2基因测序
典型的动物线粒体基因组是环状闭合的,大概有37个基因,长度在15~20kb之间,其线粒体基因排序顺序大致相同[7],要测序一个完整的基因组,本实验采取的方法是将提取的线粒体基因组中的短片段COI基因与Cob基因,用通用引物通过PCR扩增出来,在扩增的短片段上设计特异性引物,再用特异引物扩增COI与Cob之间的半个环,将两个半环拼在一块就是一个完整的基因组。
1.2.3MtDNA提取
1、1.5mL离心管里吸入35μL的ATL备用。
2、挑虫,将无水乙醇里的虫子用消过毒的挑虫针挑到上述备用的离心管中,每管只挑一只虫子(单头)。
3、用研磨棒研磨,另用145μL的ATL冲洗研磨棒。
4、加入20μL的蛋白酶K,离心。
5、金属浴(56℃,450r,3h)。
6、加入200μL的AL,轻微颠倒离心管使产生沉淀。
7、加入200μL无水乙醇,充分摇匀至油状澄清。
8、用移液枪将液体转移到过滤柱中(移柱子),放置一会,8000rpm,1min,离心,弃下液。
9、加入500μL的AW1,放置一会,8000rpm,1min,离心,弃下液。
10、加入500μL的AW2,放置一会,14000rpm,3min,离心,弃下液。
11、超净台吹干残留无水乙醇,加入100μL的AE,放置一会,8000rpm,1min,离心,将分理出的液体吸入0.2mL的PCR管中,标记好名称,放置-24℃保存(此为高浓度mtDNA)。
12、加入100μL的AE,放置一会,8000rpm,1min,离心,将分理出的液体吸入0.2mL的PCR管中,标记好名称,放置-24℃保存(此为低浓度mtDNA)
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