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H9N2亚型禽流感病毒核定位信号肽及其相关MicroRNAs在细胞中的功能验证
引言
禽流感是由禽流感病毒引起的鸟类烈性传染病[1]。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同，禽流感病毒分为16种HA亚型和9种NA亚型[2]。禽流感病毒的天然宿主是水生鸟类，如鸭、鹅、鸥等[3]。迄今为止，H1N1，H2N2，H3N2，H5N1，H7N9病毒亚型在人类中可爆发传染病[4，5]。H5N1，H5N2和H7N7病毒亚型在鸡中广泛传播[6，7]，为家禽养殖业带来巨大损失，同时更威胁人类健康。其中，H9N2亚型禽流感病毒因其致病性弱，不易感染人但病毒重组率高而成为毒株研究对象。在禽流感病毒的入侵-复制-释放周期中，目前引起关注的是其复制周期，如果能部分阻断这一过程，即有希望为禽流感病毒治疗提供一定线索。
那么怎样阻断禽流感病毒的复制周期呢？这需要一些调控因子发挥作用。常见的调控因子包括蛋白质类和RNA类，蛋白质类调控因子由蛋白质组成，有核酸结合位点和小分子结合位点，通过与小分子结合诱导其构象变化从而与核酸结合的亲和力发生变化。但因其通常以多聚体发挥作用且分子质量大不易穿过核孔，故暂不考虑作为研究对象。RNA调控因子通常是二级结构丰富的小RNA分子，存在一段单链区域能与靶标互补，形成双螺旋结构，从而阻止其他除核酸酶外的蛋白质结合，调节基因表达。RNA调控因子研究的最早也最广泛的是microRNAs。MicroRNAs(miRNAs)是一类多细胞生物中内源性的，长度22个核苷酸左右的非编码RNAs。MiRNAs由编码miRNAs的基因转录而来，其产生过程起始于细胞核，成熟于细胞质。在动物细胞中，编码miRNAs的基因在RNA多聚酶Ⅱ的作用下转录成包含一个或多个茎环结构的前体转录本primary miRNAs（pri-miRNAs）。Pri-miRNAs由类似RNase III的Drosha/DGCR8加工成约60 nt的具有发夹结构的茎环前体precursor miRNAs（pre-miRNAs），从而进入细胞核[8-10]。近期研究发现，若内含子剪切产物与pre-miRNAs结构、长度大小相似，那么无需Drosha 核酸酶的作用，pre-miRNAs也可产生，称为“mirtron”[11]。Pre-miRNAs由受体输出蛋白5（exportin-5）运出细胞核进入细胞质，并被另一种类似RNase III的Dicer酶切割形成成熟双链miRNAs。这些成熟miRNAs与RNA诱导的沉默复合体(RISC)内切酶整合，并导向靶标mRNAs 进而发挥其抑制功能。近期研究显示少数miRNAs 在 pre-miRNAs 加工成为成熟 miRNAs时依赖于Ago2 蛋白的催化活性而无需 Dicer 核酸酶参与，而这主要是由于Pre-miRNAs的片段大小和二级结构决定了其选择哪一加工过程。最终，成熟miRNAs主要通过种子区与靶标mRNAs序列的3’非翻译区(3’-UTR)的碱基配对，从而实现对mRNAs的调控作用。也有研究报道miRNAs 可与mRNAs的 5’-UTR或CDS区结合从而发挥功能。除了调控基因表达外，miRNAs还广泛参与细胞增殖、分化和凋亡、体内稳态、细胞因子反应、病毒防御以及耐受诱导等[12-13]。综上可知，miRNAs是重要的基因表达调节器，与众多重要的人类疾病息息相关，在基因表达调控和医学研究方面具有举足轻重的作用。
那么禽流感病毒复制周期中哪些会成为miRNAs调控的靶标呢？病毒被细胞内吞入细胞质后，病毒核糖核蛋白（Virus ribonucleoprotein，vRNPs）从病毒颗粒中释放进入细胞质并在核定位信号肽（Nuclear Localization Signals，NLSs）介导下入核。核定位信号肽由富含碱性氨基酸的短肽组成，是蛋白质进入细胞核的结构基础。大分子在细胞核和细胞质之间转运由核转运蛋白家族负责，包括入核转运蛋白和出核转运蛋白。可以被入核转运蛋白转运的底物蛋白包含NLSs序列，入核转运蛋白一端结合底物蛋白的NLSs，一端结合核孔复合物的核孔蛋白。冷冻电镜技术揭示了禽流感病毒vRNPs的结构模型（图1）。vRNPs是反向平行双螺旋的vRNA和RNA聚合酶（RNA polymerase）及核蛋白（nucleoprotein，NP）组成的复合物。禽流感病毒RNA聚合酶由PB1，PB2，PA组成。病毒感染宿主细胞后，vRNPs运入核内，vRNA 开始转录和复制。转录出的mRNA加帽过程由宿主完成。加帽后的mRNA有PB2的帽子结合结构域和PA内切酶结合结构域，从而进行后续复制，出核[14-16]。由此可见，病毒能够入核复制的关键在于核定位信号肽发挥其指导大分子物质入核的作用。如果miRNAs能发挥靶向病毒复制相关蛋白（包括PB1，PB2，PA及NP）核定位信号肽的作用，那么是否就能部分抑制禽流感病毒的复制呢？再者，先前已有课题组研究发现禽流感病毒在鸡树突细胞中复制量相较于其他细胞明显降低，那么miRNAs靶向病毒复制相关蛋白（包括PB1，PB2，PA及NP）核定位信号肽是否是其原因之一呢？