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摘要：为研究和缓艾美尔球虫（Eimeria mitis）的1A蛋白基因的免疫原性，根据GenBank中1A蛋白基因序列设计1对特异性引物，采用RT-PCR技术扩增出和缓艾美尔球虫的1A蛋白基因，并将其与原核表达载体pSmart-I连接，构建原核表达载体pSmart-I-1A，然后转化入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE 鉴定表达产物。结果显示，成功克隆出了和缓艾美耳球虫的1A蛋白基因，构建的重组原核表达质粒经双酶切及测序鉴定结果正确。IPTG诱导后，1A蛋白分子质量单位约为44.9kD，蛋白在菌体上清和沉淀中均有存在，主要存在于上清中。并进一步对其免疫原性进行了分析，为1A蛋白的免疫保护性研究提供了基础。 26599
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毕业论文关键词：和缓艾美尔球虫；1A蛋白基因；原核表达
Cloning and expression of the 1A protein genes of Eimeria mitis
Abstract：Studying the immunogenicity of 1A protein gene of Eimeria mitis, a pairs of specific primers were designed by the sequence of 1A protein gene in GenBank. 1A gene of Eimeria mitis amplified using RT-PCR technology, and constructed the expression vector pSmart-I-1A, then transformed into E. coli BL21, induced expression by IPTG，identified by SDS-PAGE. The results showed that the 1A protein gene of Eimeria mitis was successfully cloned, and the sequence and vector were verified correctly by double restriction enzyme digestion, sequence analysis. After IPTG induction, the molecular weight unit of 1A protein was about 44.9kD, the protein existed in supernatant and precipitation, mainly in supernatant. The immunogenicity of the 1A protein was further analyzed, which provided the basis for the study of the immune protection of the 1A protein.
Key words: Eimeria mitis; 1A protein gene; prokaryotic expression
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.1.1 虫株2
1.1.2 菌种、载体和主要试剂2
1.1.3 本实验所用溶液的配置2
1.1.4 仪器设备3
1.2 1A蛋白基因的PCR克隆4
1.3原核表达载体的构建4
1.4重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达4
1.5重组蛋白的大量表达及纯化4
2结果与分析4
2.1 1A蛋白基因的克隆5
2.2 重组质粒双酶切鉴定5
2.3 和缓艾美耳球虫1A蛋白基因的序列分析6
2.4 1A蛋白基因在大肠杆菌中的表达8
2.4.1 IPTG诱导融合蛋白的表达 8
2.4.2表达产物的可溶性分析9
2.4.3 重组1A蛋白的纯化 10
3 讨论10
致谢11
参考文献11
和缓艾美尔球虫1A蛋白基因的克隆表达
鸡球虫病是鸡常见且危害十分严重的寄生虫病，是艾美耳属球虫寄生在鸡的肠上皮细胞所造成的一类寄生虫病[1]。它引起的经济损失是巨大的。10-30日龄的雏鸡或 35-60日龄的青年鸡的发病率和死亡率能够高达80%。病愈的雏鸡增重受阻，生长缓慢，成年鸡一般不发病，但会成为带虫者，生产的价值降低，增重与产蛋能力都停滞，是传染球虫病的重要病源。如果是多种球虫混合感染，粪便中带血，并包含有大量脱落的肠粘膜细胞[2]。
和缓艾美耳球虫是一种致病力较低的鸡的球虫病，早期研究认为，其对感染动物没有什么危害，低剂量的卵囊感染一般不会引起明显的症状[3]。后来的研究发现，和缓艾美耳球虫虽然不引起明显的肉眼病变，但是当大量感染时，会使鸡的增重下降，并使饲料的转化率降低。主要的表现有生长缓慢，产蛋量下降，腿、喙部角质鳞片区黄色素量变少。肠道的表层苍白，小肠的肠壁有变薄的情况，肠内容物则很稀薄[4]。
长期以来，鸡艾美耳球虫病的防治主要依靠药物，由于长时间使用抗球虫药物，使得鸡球虫产生耐药性。因此药物残留已成为现在面临的主要问题，近年研究表明通过接种抗球虫病的重组抗原或DNA疫苗会刺激鸡体产生体液免疫和细胞免疫反应[5-6]。基因工程苗和核酸疫苗，由于其可诱导产生很强的免疫保护反应受到越来越多人的关注。当前的研究焦点多集中在球虫入侵的相关蛋白上，主要包括球虫的表面抗原及各类折射体、微线体等分泌性亚细胞器抗原[7]。