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摘要：食品高温加工过程中产生的对人体有害物质丙烯酰胺可通过添加L-天冬酰胺酶的方法得到有效控制。本实验利用基因工程技术，使以解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）为来源的L-天冬酰胺酶目的基因，通过聚合酶链式反应大量扩增并获得重组质粒pMD19-T-BaAsnase，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达，重组表达载体为pET30a-BaAsnase，获得重组L-天冬酰胺酶并通过镍柱分离纯化以研究其酶学性质。通过分析显示，重组酶活达到2.7 IU/ml，较之原始菌株提高了51倍。镍柱纯化后比活力为117.28 IU/mg，回收率41.65%。初步酶学性质研究显示，重组酶最适pH为6.0；在最适pH附近区间稳定性尚佳；最适反应温度为50℃，热稳定性实验显示重组酶热稳定性较差；金属离子及蛋白抑制剂研究表明Ca2+可明显提高重组酶活。本实验为L-天冬酰胺酶的工业化和商业化应用提供理论支撑。25976
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毕业论文关键词：L-天冬酰胺酶；基因工程；酶学性质
The cloning、expression of L-Asparaginase gene from Bacillus amyloliquefaciens and study of the enzymology properties
Abstract:Acrylamide is harmful to peoples’ health which can be produced by food processing in high temperature, and adding L-asparaginase is a good way to control it.Using genetic technology, the experiment amlified the L-asparaginase gene from Bacillus amyloliquefaciens by polymerase chain reaction ,made plasmid pMD19-T-BaAsnase, connected the recombinant expression vector pET30a- BaAsnase and transform it into E.coli BL21(DE3) to be expressed.Then purified the recombinase by nickel column to study the properties.Through analysis, according to the reorganization of the enzyme activity reached 2.7 IU/ml, compared with the original strain increased 51 times.After nickel column purification ,the specific activity is 117.28 IU/mg, the recovery rate of 41.65%.Preliminary enzymology properties study shows that the recombinant enzyme optimal pH is 6.0;the residual recombinantion activity is stable around the optimal; The optimal reaction temperature is 50℃ and the recombinant enzyme has poor heat stability;Metal ions and protein inhibitors research show that EDTA can obviously improve the recombinant enzyme activity.This experiment provided theoretical support for the industrialization and commercialization of the L-asparaginase.
Key words: L-asparaginase; Genetic engineering; Enzymology properties
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1引言1
2 材料与方法2
2.1 实验材料2
2.1.1 主要试剂、培养基2
2.1.2 菌株与质粒2
2.1.3 主要设备2
2.2 方法3
2.2.1 解淀粉芽孢杆菌L-天冬酰胺酶目的基因的克隆表达3
2.2.2 重组酶的分离纯化5
2.2.3 重组酶的酶学性质初步研究5
3 结果与分析6
3.1 L-天冬酰胺酶的基因克隆表达6
3.1.1 解淀粉芽孢杆菌基因组的提取6
3.1.2 L-天冬酰胺酶基因的扩增6
3.1.3 克隆载体pMD19-T-BaAsnase鉴定7
3.1.4 表达载体pET30a-BaAsnase鉴定7
3.1.5 重组酶诱导表达结果7
3.2 重组L-天冬酰胺酶的分离纯化8
3.3 酶学性质初步研究9
3.3.1 酶的最适pH温度及其pH稳定性研究9
3.3.2 酶的最适反应温度及其热稳定性研究10
3.3.3 金属离子及蛋白抑制剂对重组酶酶活的影响11
4 讨论11
致谢12
参考文献12
解淀粉芽孢杆菌来源L-天冬酰胺酶基因的克隆表达及其酶学性质研究
1 引言
丙烯酰胺（Acrylamide, AM）[1]可在食品高温加工过程中由美拉德反应产生，对人体有致癌作用，人体的皮肤、黏膜、消化道、呼吸道等均可接触到丙烯酰胺，对人体健康产生极大危害。近几年，国内外均对加工食品中丙烯酰胺提高了重视程度，如何有效减少加工食品中丙烯酰胺的含量已经成为了亟待解决的食品科学研究热点。