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摘要：烟酸又称尼古丁酸，它的代谢产物6-羟基烟酸是重要的合成中间体，但是6-羟基烟酸的化学合成方法步骤复杂，提纯困难。而烟酸的生物转化效率高、流程简便、不污染环境等特点，因而对烟酸的生物降解成为国内外研究热点。本实验在已找到粪产碱杆菌ZD05的烟酸相关代谢基因Nic A的基础上，通过扩增该基因片段，构建质粒载体，再经三亲接合法导入到受体菌野生HZN7中来验证该基因是否具有编码烟酸代谢酶的功能。25656
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毕业论文关键词：烟酸；6-羟基烟酸；三亲接合
Functional identification of the NicA of Nicotinic acid degradation in Alcaligenes faecalis
Abstract： Nicotinic acid, also known as NA. Its metabolites is 6-hydroxynicotinic acid，which is an important synthetic intermediate.However the chemical synthesis methods of 6-hydroxynicotinic acid are complex and difficult in purification,the biotransformation of Nicotinic acid are efficient,simple and environmentally friendly.Therefore, the biodegradation of niacin has become a hot research topic both at home and abroad. This experiment is based on the nicotinic acid metabolic genes NicA have been found in Alcaligenes faecalis ZD05. Through amplificating the gene fragment and constructing the plasmid vector, put the vector into Shinella sp.HZN7 by Tri-engagement method.Verify the gene fragment have the function of encoding Nicotinic acid metabolism protein whether or not.
Key words: Nicotinic acid；6-hydroxynicotinic acid；Tri-engagement
目 录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法4
1.1试剂、仪器及培养基 4
1.2方法 4
1.2.1烟酸降解基因NicA的PCR扩增4
1.2.2质粒提取5
1.2.3酶切质粒5
1.2.4一步法克隆5
1.2.5转化6
1.2.6三亲接合法重组菌株 6
1.2.7功能鉴定7
2结果与分析7
2.1目的片段扩增7
2.2双酶切质粒7
2.3重组菌株培养8
2.4降解功能检测9
3 讨论10
3.1 降解曲线10
3.2 待解决问题10
致谢10
参考文献10
产碱杆菌NicA基因的烟酸降解功能鉴定
引言
一、烟酸代谢研究概述
含杂环的农药化合物的开发研究，已成为近十年来农药发展的主要趋势之一。据统计,近年来开发的新农药品种，杂环化合物比重越来越高。而其中含氮杂环最多，占总含杂环农药的百分之九十以上。吡啶环是含氮杂环农药中最重要的杂环之一。从分子结构看，它相当于氮原子替代了苯环上的一个碳原子，这种由吡啶环替代苯得到的新农药化合物，内吸性高、选择性多、生物活性高，且毒性更低。
6-羟基烟酸是合成吡啶甲胺类农药的重要中间体,同时广泛用于医药和染料的合成[1]。用化学方法合成6-羟基烟酸步骤繁杂,提纯困难[2]。生物转化技术具有反应条件温和,流程简单,产品纯度高,不污染环境等特点,显示出广阔的应用前景[3-4]。利用微生物转化烟酸生产6-羟基烟酸已经成为国内外研究热点,如Nagasawa报道的荧光假单胞菌TN5菌株[5]、Hurh报道的粘质沙雷氏菌IFO12648菌株均能用于6-羟基烟酸的生产[6]。国内的袁生、戴亦军等人也曾报道过睾酮丛毛单胞菌JA1[7]和恶臭假单胞菌NA-1[8]含有烟酸代谢酶。
目前对烟酸代谢机制只有Ashraf Alhapel和Daniel J.Darley等人报道了巴氏杆菌Eubacterium barkeri中烟酸代谢机制[9]。厌氧土壤细菌巴氏芽孢杆菌分解代谢烟酸至丙酮酸和丙酸有着独特的发酵。烟酸脱氢酶是一种（非硒代半胱氨酸）含硒的四亚基酶，由ndhF（FAD亚基），ndhS（2×[2Fe-2S]亚基）和ndhL / ndM基因编码。与黄嘌呤脱氢酶家族的所有酶相反，后两者编码two-subunit molybdopterin蛋白。
催化6-羟基烟酸生成1,4,5,6-tetrahydro-6-oxonicotinate的还原反应，纯化并显示出6-羟基烟酸还原酶含有的一个和两个簇共价结合的黄素辅因子。属于酰胺水解酶家族的双功能Fe-Zn酶的烯酰胺酶介导1,4,5,6-四氢-6-氧代烟酸酯水解为氨和(S)-2-formylglutarate。后者生成(S)-2-(hydroxymethyl)glutarate的NADH依赖性还原反应由3-hydroxyisobutyrate/phosphogluconate脱氢酶家族的成员催化。含有[4Fe-4S]的丝氨酸脱水酶样酶被预测形成2-亚甲基戊二酸。在B12-dependent2-methyleneglutarate变位酶和3-methylitaconate异构酶的作用之后，乌头酸酶、异柠檬酸裂解酶家族和(2R,3S)-dimethylmalate脱水酶及裂解酶，共同完成了该途径。