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1．4．2 目的基因及载体的双酶切
为保证酶连的效率，本研究采用双酶切的方法。第一次酶切完成之后，先用DNA纯化试剂盒纯化酶切产物，然后再进行第二次酶切。酶切体系（60 μl）如下：
表4 本研究所需限制酶
待双酶切完成之后，分别取出2 μl的酶切产物与8 μl 2×Loading Buffer混合后进行电泳跑胶检测，如果出现符合目的基因片段大小并且亮度足够的条带，则可以对双酶切的产物进行纯化，将纯化后的酶切产物-20℃保藏。
1．4．3 酶连
双酶切的产物经过DNA纯化试剂盒的纯化之后，进行酶连。本研究的酶连反应需要将空白对照、载体自连以及PCR产物自连等作为对照组，以确保目的基因与载体连接。反应如下：
注：“－”:exclude; “+”: include.
酶连体系配好后，混合均匀，14℃过夜酶连。然后，向每个离心管中取出3 μl的酶连产物与7 μl 2×Loading Buffer混合后电泳跑胶检测酶连反应的效果。
1．4．4 大肠杆菌感受态的热击转化法转化
向大肠杆菌感受态细胞中转入重组质粒并筛选出阳性克隆菌株。具体步骤如下：
1） 将感受态细胞取出后，室温解冻，然后放于冰上；
2） 取200 μl解冻后的感受态细胞于新的离心管中，然后再向该离心管中加入重组质粒溶液（LA3(+)），轻轻地摇匀，后放冰上30 min；
3） 将步骤2）中的溶液放42℃水浴锅中进行热激90 s，然后放于冰上2 min；
4） 向该离心管中加入800 μl的LB液体培养基，37℃摇床200 r/min培养45 min；
5） 涂布，取出100 μl菌液涂布在含Amp的LB固体培养基上；
6） 37℃过夜培养（12~16 h）。
同时做两组对照：
对照组1：以相同体积的载体自连的DNA溶液（LA1(+)）代替重组质粒溶液（LA3(+)），其他操作同上，此对照组在正常条件下应该在含Amp的LB培养基上有少量的菌落出现。
对照组2：同样以相同体积的dH2O代替重组质粒，其他操作同上，此对照组在正常情况下应该在含Amp的LB平板上无菌落出现。
1．4．5 菌落PCR
将对照组平板上的菌落生长情况与重组质粒平板上的菌落生长情况进行对比，然后随机地从涂布重组质粒的LB+Amp的固体培养基上挑选一定量的单菌落，按编好的顺序依次点于另一块编有编号的LB+Amp得固体培养基上