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摘要酵母细胞具有能够在体内通过同源重组原理进行多个DNA片段一次性整合的能力，这使得人工构建目的DNA结构的过程大大简化。由此可见酵母细胞是人们操控基因所不可或缺的天然工具。然而，酵母细胞属于真核细胞，其细胞内质粒所含的复制子在原核细胞内不能启动，由于大肠杆菌等常见工程菌均属原核生物，因此，酵母细胞的DNA整合能力在实际应用中受到了较大限制。本实验就该问题进行了进一步探讨，构建了能够在大肠杆菌内复制的广谱质粒，并且也就如何提高酵母细胞转化能力进行探究。20551
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关键词 酵母 同源重组 广谱质粒
毕业论文设计说明书（论文）外文摘要
Title The Construction of Broad-spectrum Plasmid
vivo Yeast by Homologous Recombination
Abstract
DNA fragments can be synthesized in yeast by one step, which makes the process of DNA manipulation easier and more efficient. In contrast with ligase-dependent recombination, homologous recombination is more specific for it demands longer homologous fragments to link the different DNA fragment in order. So yeasts are useful tools in DNA manipulation. However, yeasts are eukaryotic. The replicons of the plasmids in yeasts cannot start the replication of them in prokaryotic cell in that the application of yeasts’ synthesis ability has been limited to some degrees. In this study, a broad-spectrum plasmid has been built which can express in E.coli, a kind of common engineering bacteria. Also, we explore the conditions that can improve the efficiency of the transformation of yeasts.
Keywords yeasts homologous recombination broad-spectrum plasmid
目 次
1 绪论 1
1.1 依靠酶切酶连的DNA整合方法 1
1.2 依靠同源重组的DNA整合方法 2
1.3 应用 3
1.4 pBBR1 3
2 实验过程及方法 4
2.1 实验目的 4
2.2 实验原理 4
2.3 实验器材 4
2.4 实验步骤 5
2.4.1 质粒的提取 5
2.4.2 PCR产物的扩增 8
2.4.3 酶切及片段回收 12
2.4.4 转化 13
3 结果与讨论 20
3.1 PCR扩增 20
3.2 原生质体 20
3.3 假阳性 21
结论 22
致谢 23
参考文献 24
1 绪论
DNA序列的构建在大部分代谢工程中是极其重要的，然而随着重组DNA片段长度的增加，其构建难度也就越来越大。因此，各种有效的方法、手段被快速地开发，从而帮助人们获得大DNA分子片段。并且，现今依靠可靠的分子合成技术，人们已经能够合成碱基数达兆级的DNA分子片段了。除了用来重新合成有机组织或者病毒外，这些方法还可以用来将原本操作起来过于复杂的基因分成几个较小的基因片段。
非常大的DNA片段可以通过较小的DNA片段一步一步合成出来。其总体过程为：将准备好的片段连接在之前产生的片段上，然后再将延长好的片段分离出来。这个过程不断往复，知道合成目的DNA片段。但这种一系列的DNA片段的整合，是非常缓慢的。虽然有很多这样的通过尾部单链同源片段连接DNA分子的方法，但是这样的方法所需要的同源片段长度（通常>10nt）要比限制性内切酶所产生的粘性末端（<5nt）要长，这又给这种方法带来了难度。当然除了上述方法外仍有方法可以实现多DNA片段的一步整合，而且这些方法都已经实现了大于20kb的DNA分子片段的整合。