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摘 要：氧化石墨烯(GO)具有良好的水溶性和生物相容性,并且可以吸附DNA单链并猝灭链上荧光染料的荧光，从而在生物分子的检测中应用广泛。本实验中，我们设计了一条单链DNA探针，探针的5'端荧光标记，另一端序列可以自杂交形成小发夹结构，从而形成了一个发夹引物。在目标聚合酶和dNTPs混合物存在下，发生聚合延伸形成双链DNA产物，加入GO后，仍然得到较强的荧光信号。没有聚合酶不能发生聚合延伸反应，荧光发夹引物会被GO吸附猝灭，从而实现对目标聚合酶KF活性的检测。该方法简便快速、灵敏高，还可以进一步用作聚合酶抑制剂的筛选。9231
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关键词：氧化石墨烯; KF聚合酶; 发夹引物
Fluorescent Hairpin Primer for Assay of DNA polymerase Based on Graphene Oxide and Polymerization Extension
Abstract: Graphene oxide (GO) has an excellent solubility and biocompatibility, which can also adsorb the single-stranded DNA (ssDNA) and quench its fluorescence, thus has found a wide application in biomolecular detection. In this paper, we synthesized a 5' dye-labeled ssDNA probe, and it can self-hybridize into a hairpin primer (HP). In the presence of target polymerase and dNTPs, HP can undergo polymerase elongation and generate double-stranded DNA (dsDNA). Upon addition of GO, it can also obtain a strong fluorescence signal. While the polymerization extension won’t occur in the absence of target polymerase, and the HP will be adsorbed and quenched by GO. By monitoring the fluorescence change of this system, the detection of polymerase activity can be realized. The proposed method is simple, rapid and high sensitive, which can also be used for screening the inhibitors of polymerase.
Key words: Graphene oxide (GO); KF polymerase; Hairpin primer (HP)
目 录
摘 要 1
引 言 1
1实验部分 3
1.1 仪器 3
1.2 药品与试剂 3
1.3 实验步骤 3
2 结果与讨论 4
2.1 实验原理 4
2.3 实验条件优化 5
2.4 工作曲线 7
3 结论 7
参考文献 8
致 谢 10
基于氧化石墨烯和聚合延伸的荧光发夹引物检测DNA聚合酶引 言
DNA聚合酶是一类重要的酶，该酶催化脱氧核糖核苷酸的聚合反应，以此可用来分析进入的沿着模板序列的DNA[1]。其作用是以一条DNA单链为模板，将三磷酸脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接成为与单链互补的另一条单链。聚合酶最早在大肠杆菌中发现，随后陆续在其它原核生物及微生物中找到，现已有100多个DNA聚合酶相关基因被克隆和测序。聚合酶在生命过程中发挥着中心作用，特别是在DNA复制和修复中，因此可用于诊断某些过度增生性疾病如癌症[2]。另外，DNA聚合酶被广泛用在PCR、cDNA克隆和 DNA测序等各种生物技术中。聚合酶现已成为一种重要的药物靶标[3]，对其活性的检测可作为诊断肿瘤及观察疗效的有力手段，有望成为一种重要的肿瘤标记物[4]。因此，发展快速和高效的DNA聚合酶活性的检测方法对分子生物学和药物筛检领域有十分重要的意义。
聚合酶活性检测的传统方法主要有放射性同位素标记结合凝胶电泳[5,6]，该方法操作复杂费时，也不能提供实时信息。近年来发展了一些不需放射性标记的新方法，如 PCR法[7]，能实时研究耐高温聚合酶，但是不能有效分析不耐高温的聚合酶。Brakmanns等和Summerer D等发展了标记 dNTP的方法[8, 9]和标记寡核苷酸的分子信标[12]方法，这些方法都需要对聚合酶反应的底物直接进行荧光标记,实验成本较高。近年来的报道，主要是利用荧光方法进行非放射性DNA聚合酶测定， 包括基于荧光共振能量转移（FRET）的DNA探针[10]，分子信标（MB）[11]的定量染料[12]。与放射性检测相比，荧光检测方法具有操作简便、无辐射暴露和响应迅速等优点。