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摘 要:本文利用DNA发夹引物（HP）聚合延伸前后结构的差异，用双链DNA嵌入染料SYBR Green I （SG I）做信号输出，发展了一种非标荧光方法检测T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）的活性。HP被T4 PNK去磷酸后才能聚合延伸生成双链DNA产物，嵌入SG I后，荧光显著增强，从而实现对T4 PNK的特异性检测。该方法简便灵敏，无需荧光基团标记，可应用在T4 PNK活性抑制剂的筛选，并有助于DNA损伤修复机理的研究。29539
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毕业论文关键词:发夹引物；T4多聚核苷酸激酶；聚合延伸；SYBR Green I
Fluorescence Detection of T4 Polynucleotide Kinase Activity Based on Target-induced Polymerase Extension of Hairpin Primer
Abstract：In this paper，we developed a fluorescent method for label free detection of T4 polynucleotide kinase activity．This method utilizes the structure difference of DNA hairpin primer (HP) after polymerase extension and taking SYBR Green I (SG I) as signal readout．Polymerase extension can be triggered to form double-stranded DNA product，when HP was dephosphorylated by T4 PNK．After stained by SG I，it gives strong fluorescence emission and the selective detection of T4 PNK can be realized．The proposed method is simple and sensitive，and does not require fluorophore-labels，which may find application in screening inhibitors for T4 PNK and contribute to the research of DNA repair mechanism．
Key Words：Hairpin primer；T4 polynucleotide kinase；Polymerase extension；SYBR Green I
目 录
摘 要 1
引 言 1
1 实验部分 3
1.1 实验仪器 3
1.2 实验药品和试剂 3
1.3 实验步骤 4
2 结果与讨论 4
2.1 实验原理与DNA探针设计 4
2.2 实验原理验证 5
2.3 实验条件考察 6
2.4 T4多聚核苷酸激酶性能的检测 6
3 结 论 8
参考文献 8
致 谢 11
基于目标诱导发夹引物聚合延伸策略荧光检测T4多聚核苷酸激酶
引 言
随着分子生物学和生物技术的不断进步和发展以及新技术的应用，DNA损伤和修复的研究近年来取得了很大的进展。由于DNA的损伤极易受到各种外界因素的影响，比如X-射线、化学药物等，从而导致碱基不同程度的损伤或突变，因此DNA的复制和转录过程中会使遗传信息的丢失和其他功能的丧失[1]。部分DNA损伤之后会有一个修复过程，但是由于DNA结构微小,直接检测非常复杂和困难,但是DNA的修复有以下几种类型：甲基化损伤和修复、错配修复、切除修复、DNA聚合酶刀、重组修复、微生物的DNA损伤修复、特异性代谢酶及代谢产物、DNA加合物[2,3]。DNA修复的方法随着分子生物学的不断进展也呈现出多种新型的修复方法，使DNA损伤和修复的检测越来越灵敏、准确和简单。如修复过程中是3'磷酸化的末端，需要将磷酸化的末端水解成羟基才能进行DNA的修复和聚合延伸，具有这种功能是DNA 3'磷酸酶。DNA 3'磷酸酶在核酸的代谢、DNA的损伤及修复、以及DNA复制和重组等的活动在细胞中起着至关重要的作用[4-6]。T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)是DNA 3'磷酸酶的典型代表。T4 PNK是双功能化酶，具有5'端激酶和3'端磷酸酶两种活性，是由两个不同的区域提供的。T4 PNK可以催化3'端的磷酸根水解成羟基，因为在聚合酶只作用在3'端羟基的引物上。由于其在DNA链断裂、损伤修复以及进一步探究DNA修复的机理中的重要作用，发展高灵敏度、高选择性的方法检测T4 PNK的活性具有十分重要的意义。
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